色譜分析作為重要的分離分析技術，已成為藥物研制開發、生產單位、藥品檢驗部門及醫院臨床檢驗等各個領域中藥物質量控制必不可少的方法和技術。高效液相色譜法已逐漸成為藥物分析領域中重要的分析手段及主要制備方式之一。
近年來，高效液相色譜法在藥物分析中發揮著越來越重要的作用，主要是鑒別相關物質、檢查藥物中有關物質的含量限度以及測定有效成分或主要成分含量，世界各國已將該法收載于藥典。
在HPLC法中，保留時間與組分的結構和性質有關，是定性的參數，可用于藥物的鑒別。如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項下規定：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應與對照品主峰的保留時間一致。頭孢拉定、頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進行鑒別。
用高效液相色譜法測定含量可以消除藥物中的雜質，制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾，因此藥物成分含量測定中HPLC法應用廣泛。
由于一種藥劑常含有多組分，色譜方法是既能分離又能定量的方法。如脂溶性維生素片，含有鉻維生素，有C18柱及含1%碳酸銨的甲醇為流動相。一次即可將各維生素B6、D1、A、E同時分離并定出含量。又如止痛藥或退燒藥也可用此法分離并測得各組分的含量。
RP-HPLC在HPLC各種模式中的應用最為廣泛，其特點是固定相的極性小于流動相的極性，近10幾年來，RP-HPLC，以其高分辨力、快速、重復性好等優點廣泛應用于藥物中有關物質含量的分離、分析與測定。
近年來，食品、藥品、保健品以及動物飼料等各方面頻頻出現非法添加違禁藥物的事件，這類成分往往對患者造成病情不受控制、藥物中毒等不良反應，嚴重者甚至威脅到患者生命。高效液相色譜法對添加違禁藥物的日常檢驗工作提供了有力的技術支持。
薛恒躍等建立化學官能團專屬性鑒別方法和高效液相色譜法對抗癲癇類中藥制劑中添加化學藥品苯巴比妥進行初步確認，用高效液相色譜-質譜聯用技術以對照品比對做最終確認，結果準確可靠。
保健食品中添加違禁藥物的種類較多,以往由于缺乏必要的檢測手段和法定的分析方法,一些添加違禁藥物的保健食品,一時也很難檢出其違禁藥物的成分,只有對那些少數較為明確的違禁藥物才進行有針對性的檢測。因此,必須建立完整的違禁藥物監測體系的長效機制和法定的分析方法,以確保食品安全。
HPLC法專屬性強,方法可靠, 是目前保健食品中添加違禁藥物的分析領域中應用最多的分析方法。隨著新型檢測器和高性能HPLC儀的問世,HPLC法在藥物鑒別、含量測定、違禁藥物分析中有著非常廣闊的應用前景。
