在操作高效液相色譜儀時,色譜柱是在室溫環境下工作的。大多數的工作環境溫度是不斷變化的，溫度的差別就會引起較復雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的,高效液相色譜儀方法中的洗脫方式受溫度的影響。高效液相色譜儀等度洗脫時溫度會影響保留時間，當溫度升高時所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時一般溫度每升高1C，保留時間會縮短(1~3)%。溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。溫度變化對梯度洗脫的影響要小于對等度洗脫的影響。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般也會有較大的變化。溫度變化還可能弓|起選擇性顯著變化。
正如高效液相色譜儀柱子不能完全平衡將導致保留時間的重現性差一樣，柱溫不平衡也會導致不理想的后果，這個問題在峰寬上的影響尤其明顯。
 
當溫度變化時除了選擇性和保留時間的變化之外,峰寬也會發生變化。升高溫度通常會使理論塔板數升高,峰寬變窄,由于峰面積不變,峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達到更小的檢測限。高效液相色譜儀柱子里的溫度變化也會影響峰形。當流動相和柱子之間的溫差增大時，由溫度不平衡而導致的峰變形就會加劇。
 
為了獲得一致的結果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔.絕在一個溫度波動最小的地方。
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